引言
嵌合抗原受体T细胞（chimeric antigen receptors T cells CAR T细胞）是一种基因工程化T细胞，通过修饰人源T细胞，在T细胞表面表达针对特定的肿瘤抗原的CAR，使其具备能够识别和攻击癌细胞的能力，激活免疫系统来治疗疾病。CAR-T细胞疗法具有高度的特异性，且疗效持久，在血液系统肿瘤领域以及各种恶性肿瘤的试验研究和临床治疗取得了较大突破。目前CAR T产品研发品种分为自体来源型和异体来源型，国内外共计上市10款CAR-T产品（国内4款，国外6款），均是以患者自体T细胞为基础进行修饰的自体来源CAR-T产品，容易面临T细胞制备受限、成本过高等问题。异体来源型即通用型CAR T（universal CAR T, UCAR T）使用的是健康供者的T细胞，能够实现产业化生产，有效降低生产成本，但需要对健康供者来源的T细胞受体复合物（TCR）以及其他分子进行敲除，避免在用于异体回输时候引起移植物抗宿主病（GVHD）。因此，尽管CAR-T细胞治疗在不断取得长足进步，但它仍然是一个新兴领域伴随诸多潜在风险与开发难点以及实际使用过程中的问题。非临床研究在CAR-T产品早期开发中扮演着重要角色，它的影响是多方面的，需要在设计过程中进行综合考虑和优化。本文就结合HPC过去参与过的十余个Car-T项目的申报经验对于非临床研究的一般原则要点进行简要介绍。
CAR-T细胞产品非临床研究一般原则要点
1、抗原识别域对非临床有效性和安全性的实验评估
CAR-T细胞安全性和有效性的一个主要决定因素是用于赋予目标特异性的抗原识别域，其可能来源于单克隆抗体（mAbs）、内源性配体/受体对，以及其他来源。抗原识别域的临床前评估应包括对靶抗原/细胞的特异性和亲和力的评估，以此确定其潜在非肿瘤靶向（on-target/off-tumor)和脱靶（off-target）毒性。因此为了避免抗原识别域引入的非预期靶向毒性，脱靶毒性，以及细胞因子依赖性生长和不受控增殖这类安全性问题，FDA推荐如下体外和体内研究：
（1）使用具有相同抗原识别域的单克隆抗体或融合蛋白进行组织交叉反应性研究；
（2）使用蛋白质阵列技术（Membrane Proteome Array试验）分析与靶抗原的结合亲和力和特异性；
（3）在各种器官/组织的人类原代细胞、细胞系或诱导多能干细胞衍生测试系统中进行细胞毒性/细胞因子释放测试；
（4）相关动物模型，即分析非预期靶向性的毒性，或体内脱靶效应；
（5）靶抗原表征（结合临床经验和靶抗原组织表达谱）以及抗原依赖性增殖评估。
此外，FDA建议申报时可以参考引用CAR或具有相同抗原识别域的单克隆抗体的临床经验，或可减少/消除进行额外特异性和亲和力测试。FDA鼓励申办方探索多种方法的组合，以最小化对研究受试者的风险，并为临床试验的设计提供信息。
2、CAR-T细胞成分的非临床考量
表达CAR转导的T细胞（纯化的T细胞亚群；（2）包含其他污染细胞（例如NK细胞、B细胞等）的未纯化的T细胞；（3）病毒抗原（例如巨细胞病毒（CMV）、EB病毒）的特异性T细胞；（4）干细胞样或“年轻”T细胞）也会影响最终研究产品的生物活性。由于细胞来源不同，T细胞发生不受控增殖和毒性的可能性也可能不同。非临床评估应包括：
（1）不受控增殖检测；
（2）体外/体内T细胞克隆性检测；
（3）核型分析；
（4）TCR重排分析；
（5）针对病毒抗原特异性T细胞，还需要通过体外刺激和识别检测评估对病毒抗原的特异性；
（6）对于异体来源的CAR-T细胞，我们建议提供数据以解决诸如移植物抗宿主反应（GVHD）或宿主排斥CAR-T细胞等问题。
3、CAR-T细胞的体内试验
动物试验可用于展示CAR-T细胞功能性以及概念性验证，包括以下试验模型：
（1）小鼠异种移植模型（即使用人类CAR-T细胞的人类肿瘤异种移植小鼠模型）中进行的体内试验可以提供有关CAR-T细胞的转移和增殖特征信息；
（2）在有相关替代产品可用的情况下，同基因肿瘤动物模型可以提供有关替代CAR-T细胞与完整宿主免疫系统的相互作用信息，以及潜在的非肿瘤靶向（on-target/off-tumor)的信息；
（3）若使用其他模型，应提供数据支持模型的适用性，如抗原识别域与人类靶点与动物靶点的结合亲和力，以及靶抗原在被评估物种中的表达谱。
4、针对经过其他修饰的 CAR-T 细胞的非临床考量
CAR-T细胞可以通过基因编辑等方法加入其他基因（如自杀基因、检测/选择基因或免疫调节元件等）从而提高CAR-T细胞的抗原识别能力，T细胞持久性，细胞增殖能力，或控制T细胞活性。对于经过基因修饰的CAR-T细胞，可能需要进行额外的非临床试验，以评估特定元件的功能性和CAR-T产品的安全性，内容如下：
（1）混合淋巴细胞反应有助于评估经过改造以减少GVHD风险和对同种异体产品免疫应答的产品的免疫原性；
（2）影响 CAR-T 细胞持久性的其他修饰可通过细胞因子依赖性生长试验或适当设计的体内研究进行评估；
（3）当加入自杀基因和细胞标记/标签时，FDA建议通过非临床研究以证明其功能，并确定对诱导 CAR-T 细胞耗竭至关重要的任何额外药物或生物制品的剂量。
CAR-T细胞安全性和活性考量因素总结
定义CAR-T细胞安全性和活性的参数是多因素的，需要考虑的因素诸如：
(1) CAR结构的设计（例如，抗原识别域、信号域、跨膜域和铰链域）；
(2) 外源载体递送方法；
(3) T细胞来源；
(4) 操作过程（例如，激活、细胞选择）；
(5) 生物活性（例如，细胞因子表达谱、细胞毒性、增殖）；
(6) CAR-T细胞的修饰（例如，自杀基因、检测/选择基因、免疫调节元件、基因组编辑或基因沉默技术）；
(7) 给药途径。
FDA表示一个全面的非临床研究计划应该采用多种测试策略的组合。这些信息，以及相关的非临床和临床数据，可以为临床试验设计提供信息，并支持对研究性CAR-T细胞的人体给药。
参考文献
［1］Considerations for the Development of Chimeric Antigen Receptor (CAR) T Cell Products, U.S. Department of Health and Human Services. Food and Drug Administration, Center for Biologics Evaluation and Research, January 2024.
